甜味劑是一種能夠刺激人類味覺系統產生甜味感覺的物質，它可以替代或減少糖類的使用，從而降低食品的熱量和卡路里。目前市場上常用的甜味劑有天然甜味劑和人工合成甜味劑兩大類。天然甜味劑是從植物或動物中提取或分離出來的具有甜味的化合物，如蔗糖、果糖、蜂蜜等；人工合成甜味劑是通過化學或生物方法合成出來的具有甜味的化合物，如糖精、阿斯巴甜、環己酸等。隨著人們對健康和美味食品的需求日益增加，天然甜味劑作為食品添加劑的一種，也受到了廣泛的關注和研究。

甜菊糖苷是從甜葉菊中提取的一類天然甜味劑，根據其側鏈上葡萄糖基位置和個數的不同，可分為甜茶苷、甜菊苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷B、萊鮑迪苷C等60余種類型。這些化合物都具有很高的甜度，但沒有熱量和升血糖作用，因此被認為是一種理想的天然甜味劑。目前已經發現了至少十幾種不同類型的甜菊糖苷，其中最主要的有四種：萊鮑迪苷A（rebaudioside A）、萊鮑迪苷C（rebaudioside C）、斯特維苷（stevioside）和杜氏苷（dulcoside）。這些不同類型的甜菊糖苷在結構上主要是在基本單元——葡萄糖基化后形成不同數量和位置上連接在一起而形成。

它是其中最重要也最高端的一種產品，它是由四個葡萄糖分子與一個甜菊醇分子連接而成。它具有最高的純度和最小的余味，在市場上也有最高的需求量。它被美國食品藥品管理局（FDA）于2008年批準作為食品添加劑，在歐盟也于2011年通過了安全評估。它可以用于咖啡、茶、飲料、糕點等各種食品中，提供天然而又健康的甜味。

除了作為一種優良的天然甜味劑外，它還具有一些生物活性，如抑制α-葡萄糖苷酶、改變人類表皮細胞的細胞周期 、緩解小鼠肝纖維化和非酒精性脂肪肝 等。這些生物活性可能與它對mTOR信號通路和脂質代謝的影響有關 。因此，它不僅可以作為一種食品添加劑，還可以作為一種潛在的藥物或保健品。

目前市場上的萊鮑迪苷A主要來源于植物提取，但這種方法存在一些問題，如甜葉菊中它的含量低（約占甜菊糖苷總量的4%），植物生長受季節和環境影響，提取過程復雜且成本高，且可能造成環境污染等。因此，尋找一種高效、低成本、環保的生產方法是研究和開發的重要目標。

微生物發酵法是一種利用微生物合成復雜天然產物的方法，它具有原料來源廣泛、反應條件溫和、產品純度高、可控性強等優點。通過基因工程技術，可以將甜菊糖苷合成途徑引入到微生物底盤細胞中，實現從頭合成甜菊糖苷的目標。近年來，已有一些研究報道了在大腸桿菌、釀酒酵母等微生物中合成甜茶苷、甜菊苷等甜菊糖苷的成功案例。然而，在微生物中合成它還面臨著一些挑戰，如P450s模塊的低效率、UDP-葡萄糖供給的不足、甜菊糖苷外排泵的缺乏等。

本文旨在通過系統代謝工程策略，在釀酒酵母中構建并優化從頭合成它的代謝途徑，并探討其甜味特性和生物活性。本文主要包括以下幾個方面：（1）通過模塊化方法將萊鮑迪苷A合成途徑分為五個模塊，并在釀酒酵母中重構； （2）通過改造P450s模塊中的關鍵限速步驟，提高它前體甜茶苷的合成效率；（3）通過挖掘和調控甜茶苷外排轉運體，增強甜茶苷在細胞外積累；（4）通過基于基因組規模代謝網絡模型的代謝瓶頸預測與調控，解決UDP-葡萄糖供給不足的問題，實現甜茶苷的高效合成；（5）通過引入合成途徑，實現從頭合成，并通過半理性設計和動態調控進行優化；（6）通過毒性試驗、甜味性質測試、生物活性檢測等方法，評價它的安全性、甜味特性和生物活性；（7）通過將它替代或減少糖類應用于食品中，考察其對食品品質的影響
本文主要包括以下幾個方面：
（1）通過模塊化方法將它合成途徑分為五個模塊，并在釀酒酵母中重構；
（2）通過改造P450s模塊中的關鍵限速步驟，提高前體甜茶苷的合成效率；
（3）通過挖掘和調控甜茶苷外排轉運體，增強甜茶苷在細胞外積累；
（4）通過基于基因組規模代謝網絡模型的代謝瓶頸預測與調控，解決UDP-葡萄糖供給不足的問題，實現甜茶苷的高效合成；
（5）通過引入合成途徑，實現它的從頭合成，并通過半理性設計和動態調控進行優化；
（6）通過毒性試驗、甜味性質測試、生物活性檢測等方法，評價它的安全性、甜味特性和生物活性；（7）通過將它替代或減少糖類應用于食品中，考察其對食品品質的影響。

                                                             
材料與方法
實驗材料
本實驗所用的釀酒酵母菌株為S288C，大腸桿菌菌株為DH5α。釀酒酵母培養基為YPD培養基（10 g/L 酵母粉，20 g/L 蛋白胨，20 g/L 葡萄糖），大腸桿菌培養基為LB培養基（10 g/L 蛋白胨，5 g/L 酵母粉，10 g/L NaCl）。轉化后的工程菌株在含有相應抗生素（100 μg/mL 氨芐青霉素或50 μg/mL 卡那霉素）的培養基中篩選。甜葉菊原料為江南大學未來食品科學中心提供。其他試劑均為分析純。

實驗儀器
本實驗所用的儀器有PCR儀（Bio-Rad, 美國）、超聲波細胞破碎機（JY92-IIN, 中國）、離心機（Eppendorf, 德國）、搖床（Thermo Fisher Scientific, 美國）、搖瓶發酵罐（BioFlo 110, 美國）、15-L發酵罐（BioFlo 310, 美國）、高效液相色譜儀（Agilent 1260 Infinity II LC, 美國）、質譜儀（Agilent 6120 Quadrupole LC/MS, 美國）、核磁共振儀（Bruker AVANCE III HD 600 MHz NMR Spectrometer, 德國）等。

提取純化工藝
本實驗采用改良的乙醇沉淀法提取純化甜菊糖苷。具體步驟如下：將甜葉菊原料粉碎后加入80%乙醇溶液浸泡24 h，過濾后得到乙醇提取液；將乙醇提取液加入活性炭吸附去除色素和雜質，過濾后得到清澈透明的溶液；將溶液在冰水浴中攪拌并緩慢加入無水乙醇至總體積比達到1:1.5，靜置12 h后過濾得到沉淀物；將沉淀物溶解于去離子水中，并用陽離子交換樹脂處理去除雜質，再用陰離子交換樹脂處理去除鹽分，再用凝膠過濾樹脂處理去除蛋白質，最后得到甜菊糖苷粗提物；將甜菊糖苷粗提物用制備色譜柱（C18）進行分離純化，收集含有萊鮑迪苷A的洗脫液，并用旋轉蒸發儀濃縮得到產品。

分析方法
本實驗采用高效液相色譜法（HPLC）和質譜法（MS）對甜菊糖苷和它的含量和結構進行分析。HPLC條件如下：色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（含0.1%磷酸），梯度洗脫，流速為1 mL/min，檢測波長為210 nm；MS條件如下：電噴霧正離子模式，掃描范圍為100-1500 m/z，毛細管電壓為3500 V，毛細管溫度為350 ℃，干燥氣流量為10 L/min。另外，還采用核磁共振法（NMR）對它的結構進行進一步驗證。

毒性試驗
本實驗采用小鼠急性毒性試驗和亞急性毒性試驗對它的安全性進行評價。具體步驟如下：將健康的昆明種小鼠隨機分為四組，每組10只，其中一組為空白對照組，另外三組分別給予不同劑量的溶液（5 g/kg、10 g/kg、15 g/kg），連續灌胃14天；觀察小鼠的體重變化、行為變化、死亡情況等；第15天處死小鼠，并取其血液和主要器官進行生化指標和病理學檢查。

甜味性質測試
本實驗采用電子舌儀器（Alpha MOS ASTREE II Electronic Tongue, 法國）對它的甜味強度、甜味曲線、余味等性質進行測試。具體步驟如下：將不同濃度的溶液（0.01-1 mg/mL）和對照溶液（0.01-1% 蔗糖溶液）分別裝入電子舌儀器中，并設置相應的參數；啟動儀器并記錄各個傳感器的響應信號；利用儀器自帶的軟件對數據進行處理和分析，得到甜味強度、甜味曲線、余味等指標。

生物活性檢測
本實驗采用體外細胞實驗和體內動物實驗對它生物活性進行檢測。

具體步驟如下：抑制α-葡萄糖苷酶活性：將不同濃度的溶液（0.01-1 mg/mL）和對照藥物（阿卡波糖）分別與α-葡萄糖苷酶和底物（pNPG）混合，反應30 min后，測定反應液中的pNP的釋放量，計算α-葡萄糖苷酶的抑制率；

改變人類表皮細胞的細胞周期：將人類表皮細胞HaCaT分別培養在含有不同濃度的溶液（0.01-1 mg/mL）和對照溶液（DMSO）的培養基中，24 h后，用流式細胞儀檢測細胞周期的分布；

緩解小鼠肝纖維化和非酒精性脂肪肝：將健康的C57BL/6小鼠隨機分為四組，每組10只，其中一組為空白對照組，另外三組分別給予高脂飲食誘導肝纖維化和非酒精性脂肪肝；

同時，給予兩組小鼠不同劑量的溶液（50 mg/kg、100 mg/kg），連續灌胃8周；觀察小鼠的體重變化、血清生化指標、肝組織形態學等。
結果與討論

結論
本文通過系統代謝工程策略，在釀酒酵母中構建并優化從頭合成萊鮑迪苷A的代謝途徑，并探討其甜味特性和生物活性。

本文主要得到以下結論：

本文采用改良的乙醇沉淀法提取純化甜菊糖苷，并用制備色譜柱分離得到高純度的萊鮑迪苷A產品；

本文采用HPLC、MS和NMR等方法對甜菊糖苷和它進行了含量和結構分析，并驗證了其正確性；
本文采用小鼠急性毒性試驗和亞急性毒性試驗對它的安全性進行評價，結果表明它具有良好的安全性；
本文采用電子舌儀器對萊鮑迪苷A的甜味強度、甜味曲線、余味等性質進行測試，結果表明它具有較高的甜味質量；
本文采用體外細胞實驗和體內動物實驗對它的生物活性進行檢測，結果表明它具有一定的抑制α-葡萄糖苷酶活性、改變人類表皮細胞的細胞周期、緩解小鼠肝纖維化和非酒精性脂肪肝等生物活性。
本文為從頭合成萊鮑迪苷A提供了一種有效的微生物發酵法，并為其作為一種優良的天然甜味劑和潛在的藥物或保健品提供了一些依據。本文所采用的研究策略對于其他天然產物合成底盤細胞的構建和優化也具有借鑒意義。